我国柑橘主要病毒类病害及其脱毒技术研究进展
李 月等
柑橘是我国重要的经济作物之一，近5年来我国柑橘产业一直保持着稳步发展的势头，种植面积与产量均稳步增长 。但随着柑橘种植面积的不断扩大，病害问题也接踵而至。柑橘极易感染一种或多种病毒类病害，导致植株生长发育受阻、产量降低、果品品质变劣，严重者甚至导致植株死亡 。柑橘病毒类病害主要由病毒和类似病毒引起，即由病毒、类病毒、螺旋体和植原体等病原引起的 。目前，世界上已报道的柑橘病毒和类似病毒病约有80余种，多具有易传播、危害性大、多种病原复合侵染率高、感染后树体终身带毒和难以防治等特点 。我国较常见且对柑橘生产危害较大的病毒类病害主要有柑橘黄龙病、裂皮病、衰退病和碎叶病等。这些病害均可通过苗木转运和芽条嫁接引种进行远距离传播，同时还能在田间通过农事操作和昆虫等进行近距离扩散。目前，针对柑橘病毒类病害尚无有效的防治措施，只能通过严格检疫、对本地良种进行脱毒处理、创建无病毒苗木繁育和推广体系、对已有疑似感染果树进行检测，并对病株进行铲除等手段进行防控。为此，本文就我国常见柑橘病毒类病害的病原性质、症状表现及脱毒技术的研究现状进行了概述，以供参考。
1 我国柑橘主要病毒类病害
1.1 柑橘黄龙病（Cirtus Huanglongbing，HLB） 柑橘黄龙病病原最初被判断为病毒 ，之后广西柑橘黄龙病研究小组通过四环素试验间接证明黄龙病病原不是病毒而是类菌原体 。有研究者通过电镜观察以及青霉素试验认为黄龙病病原为类立克次氏体。近年来，随着分子生物学技术的发展，通过对黄龙病病原的16S rD⁃NA测序比对后证实黄龙病的病原菌是细菌 。柑橘黄龙病病原菌属韧皮部杆菌属（Candidatus Liberobacter），根据其16S rDNA的相似性可分为亚洲种（Candidatus Liberi⁃bacter asiaticus）、非洲种（Candidatus Liberibacter africa⁃nus）和美洲种（Candidatus Liberibacter americanus） 。
我国的柑橘黄龙病病原菌属亚州种，其传播方式主要为柑橘木虱传播、嫁接传播以及运输传播。柑橘黄龙病在田间的症状十分复杂，常见症状为叶片斑驳黄化、新梢均匀黄化、缺素型黄化、红鼻子果等，其中典型症状为叶片斑驳黄化。目前，国内外检测柑橘黄龙病的常用诊断方法为PCR检测方法 。
1.2 柑橘裂皮病（Citrus Exocortis Viroid，CEVd） 柑橘裂皮病是由柑橘裂皮类病毒引起的，属马铃薯纺锤形块茎类病毒科马铃薯纺锤形类块茎病毒属，分强毒株系和弱毒株系 。CEVd类病毒为低分子量RNA，不编码蛋白，RNA以线状和共价闭合环状2种分子形式共同存在于寄主体内 。由于CEVd具有棍棒状二级结构，钝化温度高，110℃下保持15min后仍具有侵染力，直至140℃其感染力才呈线性下降 。CEVd可感染多个柑橘种和品种，以枳壳及其杂种作砧木的柑橘易感，症状表现为砧木部分树皮纵向开裂、翘起、剥落、流胶，树冠矮化，树势生长变弱，常通过苗木的转运和嫁接进行传播。目前，我国创建了sPAGE、RT-PCR、斑点杂交、组织印迹杂交等一套完整的检测体系，为CEVd的检测和监控提供参考依据。
1.3 柑橘衰退病（Citrus Tristeza Virus，CTV） 柑橘衰退病由柑橘衰退病毒引起，属长线性病毒科（Closteroviri⁃dae）长线性病毒属（Closterovirus），其基因组由单链正义RNA（ssRNA）组成，含19296个核苷酸，是已知植物病毒中基因组最大的病毒，外壳蛋白分子量为25kDa 。衰退病毒根据其症状表现可分为以下3种类型：速衰型（quick decline，QD），引起植株逐渐或快速的衰退或死亡；茎陷点型（stem pitting，SP），引起感染植株茎枝木质部出现凹陷点或沟，同时导致树体矮化、树势衰弱、生长迟钝等；苗黄型（seedling yellow，SY），引起植株叶片黄化。其中，速衰型和茎陷点型的株系为强毒系，苗黄型的株系为弱毒系，可用一些弱毒株系通过交叉保护的方式防治强毒株系的危害 。柑橘衰退病除通过嫁接传播外，在田间还可通过橘蚜、棉蚜、橘声蚜、桃蚜和绣线橘蚜传播，其中橘蚜传毒能力最强 。
1.4 柑橘碎叶病（Citrus Tatter Leaf Virus，CTLV）柑橘碎叶病最初在北京柠檬和温州蜜柑上被发现，主要通过汁液进行传播，嫁接工具是其主要传播途径，远距离传播则是带毒苗木和接穗，目前尚未发现昆虫传播 。
CTLV属发状病毒科（Capilloviridea）发状病毒属（Capillo⁃virus）单链正义RNA（ssRNA）病毒，呈弯曲线状颗粒，大小（600～700nm）×（13～15nm），基因组包含6496个核苷酸，蛋白外壳的分子量为27kDa。此外，具有3'端的poly（A）尾巴和2个开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码242kDa前体蛋白和36kDa运动蛋白 。该病毒寄主范围广，能够感染多个柑橘品种。我国枳壳砧的宽皮柑橘类品种发病较重，常见症状为砧穗结合部位肿大并形成明显的黄色环，植株叶片碎小缺损，树势衰弱甚至死亡。
2 柑橘病毒脱毒技术
2.1 热处理及化学处理脱毒 热处理脱毒法是最早和最普遍的果树脱毒处理方法之一，其利用病毒不耐高温的特点，通过加热使植株中的病毒钝化失活，从而起到脱除病毒的作用。由于不同种类病毒的热抗性不同，常使用35～40℃的温度范围进行热处理 。通常热处理对线状病毒、类细菌、类菌质体等引起的病害有效，而对耐热性高的类病毒如裂皮病病毒等则没有效果 。常用的热处理方法有热水处理法和湿热空气处理法。热水处理法对休眠器官或离体接穗的效果较好，通常将待处理部分浸泡50℃左右的热水中，一定时间后剥取其休眠芽进行接种；湿热空气法则对生长活跃的茎尖效果较好，通常是将待处理部分置于35～40℃下处理一定时间，可采用昼夜交替、低温交替或隔日高温的形式进行 。对于不同病原菌及不同的植株，采用合适的处理时间与温度是热处理法成功的关键。化学处理脱毒多采用化学药品进行处理，如嘌呤嘧啶类似物、抗生素、氨基酸等，其作用是抑制植株内病毒的复制，目前柑橘上常用的是四环素 。有研究发现，对黄龙病病原的脱除，加热与四环素相结合进行处理，较单独进行热处理或四环素处理的效果要好 。
2.2 茎尖培养脱毒 茎尖培养脱毒法的依据是：病毒通过植物维管束和胞间连丝进行传播，而植物分生区尤其是茎尖生长点（约0.1～0.5mm区域）无维管束，且细胞分裂增殖速度较病毒扩散速度快，因此茎尖生长点含毒量极低，切取这类微小的无病毒组织进行培养即可获得无病毒植株 。一般情况，切取的茎尖越小，脱毒效果越好，但随着剥取的组织越小，其成活率会降低，因此，对于不同的植株需要选择合适的茎尖大小，以保证较好的脱毒效果和较高的成活率。
2.3 茎尖嫁接脱毒 由于茎尖培养脱毒法所取茎尖组织微小，不易培养，生根率和移栽成活率均较低，因而衍生出既能利用无毒茎尖组织嫁接，又能解决茎尖培养不易生根和成活的茎尖嫁接脱毒法。该方法于1972年由Mu⁃rashige等首先提出，1975年Navarro等 加以改进，现已成为国内外广泛采用的脱毒方法。国内研究也表明，茎尖嫁接可以脱除柑橘黄龙病、柑橘裂皮病等病原体 。影响茎尖嫁接成活的因素有：砧木品种、接穗选取、茎尖大小以及嫁接方法等 。由于茎尖嫁接仍然存在因茎尖较小而导致成活率较低，以及对部分病毒如碎叶病等的脱除无效，国内外学者使之与热处理相结合，在茎尖嫁接前通过一定时间和温度的热处理即可获得满意的脱毒效果，成功脱除出柑橘黄龙病、衰退病、裂皮病、碎叶病及鳞皮病等多种病毒类病害 。
2.4 其他脱毒方法 除以上脱毒方法外，脱毒途径还有珠心培养法、超低温脱毒法、愈伤组织脱毒法等。其中，超低温脱毒是目前研究的新方向，其原理是：在降低温度的过程中，细胞因含水量较高，易形成较多冰晶，使得细胞破裂受损而亡，仅有生长点的分生组织能够存活下来，病原体失去寄主细胞而被脱除。目前，该技术在柑橘脱毒上的应用仍较少，丁芳 研究发现，采用包埋玻璃化法对柑橘茎尖进行超低温处理，其黄龙病、衰退病以及裂皮病的脱毒率分别达91.6%、90.0%和88.8%。陈毅群等采用超低温处理与茎尖嫁接相结合对红江橙、沙田柚、椪柑、北京柠檬和萝岗甜橙等5个柑橘品种进行黄龙病病原菌的脱毒处理，脱毒率达98.1%。
3 展望
创建柑橘无病毒苗木繁育体系是我国现代柑橘产业发展的趋势，其中嫁接用茎尖接穗的脱毒处理是影响无病毒苗木成活率的重要因素。茎尖嫁接脱毒法是柑橘苗木中运用最为广泛的脱毒技术，但是单一的脱毒方法往往无法脱除多种病原菌，为获得更好的脱毒效果，常采用物化处理与茎尖嫁接相结合的方式，如热处理与茎尖嫁接相结合，化学药物处理与茎尖嫁接相结合，以及近年来兴起的超低温处理与茎尖嫁接相结合。抗病毒转基因技术通过基因工程技术在柑橘植株内转入外源抗病毒基因，促使植株可以在体内表达对相应病原菌的抗性，也为柑橘无病毒苗木的繁育提供了一条新的途径。
